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實時熒光定量PCR技術

技術簡介

實時熒光定量PCR技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR）是在定性
PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied biosystems公司推出，
在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過
Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(或cDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA
(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。

技術原理

在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨
著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背
景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點
上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。

技術優勢

1、通過引物或探針與模板的特異性雜交來鑒別模板，具有很高的準確性、假陽性低，特異性好。

2、光譜技術和計算機技術的聯合使用，極大提高了檢測的靈敏度，甚至可以檢測到單拷貝的基因。

3、不受擴增效率和試劑損耗的影響，可以利用指數期的Ct值定量起始模板量，精確性高。

4、可以將擴增和檢測同步完成，不需開蓋，不僅交叉污染和污染環境機會少，且自動化程度高。

5、沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照，實時縮短了反應時間。

應用范圍

1、 DNA或RNA的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物拷貝數的檢
測，RNAi基因失活率的檢測等。

2、基因表達差異分析。例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理
處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA或差顯結果的確證。